В работе представлены результаты оценок изменений электропроводимости и катионного состава молока продуктивных коров в зависимости от степени поражения маститом молочной железы. Полученные зависимости объяснены усилением пассивного транспорта катионов преимущественно за счёт изменения некоторых характеристик структуры воды, исследованной методом перколяции, и связанных с этим размеров "поры" биологических мембран и гидратных оболочек ионов в процессе гипертермии молочной железы.
В этиологии маститов у коров и развитии желудочно-кишечных заболеваний у новорождённых телят важное место принадлежит инфекционному фактору. Согласно данным Урбана В.П. с сотрудниками [1] молозиво матерей, больных маститом или имеющих скрытый мастит, становятся причиной дизбактериоза в желудочно-кишечном тракте молодняка с последующим развитием тяжёлых, включая и токсичные, форм диспепсий. Одним из основных вопросов в системе борьбы с маститом продуктивных коров является ранняя его диагностика. От своевременного и правильно поставленного диагноза зависит эффективность проводимых лечебных и профилактических мероприятий. В связи с этим любые методы, позволяющие контролировать качество молока, представляются важными в деле профилактики заболеваний не только потомков доноров молока, но и других потребителей молочных продуктов, включая и человека. Информативность и надёжность методик и приборов ранней диагностики заболеваний молочной железы определяется их экспериментальным и теоретическим обоснованием. Несмотря на значительное число работ, посвящённых исследованиям заболеваний молочной железы [2-6], при разработке электронных приборов экспресс-диагностики состояния последней путём безреагентного анализа небольшой пробы молока ("ЭЛЕКСАМ") возникла необходимость исследований состава и свойств молока продуктивных коров в зависимости от степени поражения маститом молочной железы. В данной работе представлены результаты таких оценок для электропроводимости и содержания катионов натрия, калия (и кальция) в молоке коров преимущественно черно-пестрой породы.
Электропроводимость проб свежего молока измеряли в термостатных условиях при 293 К на частоте 1 кГц прибором Е8-2, используя устройство [7], в котором электроды соединены каналом на поверхности диэлектрического элемента, опущенного в сосуд (пробирку) с молоком. Параллельно проводили измерение катионного состава молока по методике [8]. Стадии заболевания маститом контролировали по 5-ти бальной системе реакцией молока с 5 %-ным димастином. Результаты нескольких серий измерений (232 пробы) обработаны на ПЭВМ и представлены в виде достоверных корреляционных зависимостей электропроводимости молока (Y, мСим / м)
где B изменяется от 1 при "норме" (-) до значения 5 при мастите (++++).
Закономерности (1-4) в целом согласуются с данными [2,6]. В случае теста "норма" (B=1) учтены пробы как типа "коровы здоровые", так и типа "доли здоровые". Как следует из уравнения (1), чем хуже (больше) показатель димастиновой пробы (B), отражающий предмаститное и маститное состояния, тем больше электропроводимость молока. Увеличение концентрации катионов с ростом параметра B наблюдается только в случае натрия (ур. 2), тогда как для катионов калия и кальция (ур. 3-4) эта зависимость обратная, причем для калия она более существенна, чем для кальция.
Электропроводимость непосредственно связана с содержанием электролитов в среде соотношением [9]
где X(i) - молярная доля i-того компонента в смеси электролитов; y(i) - электропроводимость i-того однокомпонентного раствора при суммарной концентрации. Рассматривая в качестве компонентов хлориды натрия, калия и кальция в молоке, учитывая правило Писаржевского-Вальдена [10], соотношения (2-4) и различие вязкостей молока и растворов смеси электролитов, используя также молярные электропроводимости [11], по формуле (5) получим значения электропроводимости молока (в мСим / м) 440, 520 и 600 при значениях B, равных 1, 3 и 5, соответственно. Сравнение результатов такого расчёта с данными уравнения (1) при тех же, показывает, что хлориды учтённых уравнениями (2-4) катионов вносят вклад в электропроводимость молока не менее 95 %. Вклад других носителей электрических зарядов находится в пределах погрешностей экспериментов и расчётов.
Из представленного материала следует, что с ростом степени поражения маститом молочной железы наиболее существенные изменения в катионном составе молока претерпевают концентрации натрия и калия. Появление последних в молоке не является результатом биохимических процессов секреторной деятельности клеток молочной железы. Ионный состав молока существенно отличается от такового в крови [2], что следует рассматривать как результат высокоэффективного трансмембранного переноса вещества против концентрационного градиента (М) и электрического градиента мембраны (Е). Так что переносу какого-либо иона в поле электрохимического градиента соответствует поток вещества [12]
где D и K - коэффициент диффузии и константа электрического переноса. В случае катионов калия и натрия, например, реализуется эффект "калий-натриевого насоса", обеспечивающего высокие концентрации катионов калия и низкие - для натрия в молоке относительно таковых в крови. Как следует из уравнений (2-3) , по мере развития мастита (увеличение B) эффективность калий-натриевого насоса снижается. Понижение эффективности переноса иона (i) оценим по
где Cк, Cп и Cн - концентрации иона (i) в крови и в молоке при патологии и норме, соответственно. Формула (7) даёт понижение эффективности переноса ионов, равное нулю, в норме (B=1 в (2-3)). При патологии (например, при B = 5 в (2-3)), используя значения концентраций ионов в крови (в мг-экв / л) C Na+ = 143.5 и C K+ = 5.1 [2], подстановкой данных из (2-3) по формуле (7) получим для натрия K Na+ = 34.6 % и K K+ = 23.6 % - для калия. Отношение полученных величин равно 1.47. Из результатов проведённой оценки следует, что, несмотря на значительное изменение содержания рассматриваемых ионов в молоке по мере развития мастита (особенно в случае катионов натрия), эффективность работы калий-натриевого насоса в молочной железе остаётся высокой и снижается в случае Na+ в 1.5 раза больше, чем в случае катионов калия.
В трансмембранном транспорте ионов натрия и калия можно выделить две основные составляющие: активную, направленную против электрохимических градиентов, и пассивную, направление которой совпадает с последними [12]. Первая из них связывается с прохождением катионов через биологические мембраны в виде липидорастворимых комплексов с веществами, называемыми ионофорами, обладающими высокой селективностью к катионам благодаря определённому пространственному расположению функциональных групп [13]. В этой составляющей выделяют основные ступени процесса: десольватация катиона, комплексообразование, прохождение через липидные бислои в виде гидрофобной системы на противоположную сторону мембраны, распад комплекса, сольватация иона и изменение конформации ионофора с последующим возвратом его в исходное состояние. Лиганды имеют водородные связи, образующиеся с окружающей средой в процессе изменения конформации. Предполагается, что понижение эффективности калий-натриевого насоса в процессе развития мастита за счёт снижения роли активной составляющей переноса может быть связано с особенностями изменения структуры растворителя и гидратации ионов в процессе гипертермии железы. Оба последних фактора могут существенно проявляться и в увеличении роли пассивной составляющей переноса ионов по мере развития мастита. Увеличение пассивного трансмембранного транспорта может быть связано как с увеличением коэффициентов диффузии (из-за повышения температуры жидкостей, омывающих обе стороны мембран клеток молочной железы и сосудистого русла), так и с изменением функционального состояния клеток, которое изменяет остальные параметры уравнения (6) в процессе гипертермии молочной железы. В связи с отмеченным необходимо остановиться на некоторых особенностях структуры воды и сольватации ионов, являющихся важными элементами структуры системы, транспортируемой клетками железы из сосудистого русла через мембраны [14].
В соответствии с теорией перколяции (протекания) [15], которая ставит в общем виде и решает задачу о связности системы водородных связей, лежащей в основе структуры воды [16], мономеры жидкости могут находиться в составе бесконечного кластера с непрерывной сеткой водородных связей (I) и в виде свободных мономеров или замкнутых n-меров (II). Доля мономеров в состоянии II (золь-фракция, s) может быть найдена из соотношения [17]
где z = 4 [15-17]. Жидкая фаза воды по физическим свойствам должна быть отнесена к "золям", соответственно, величина p - равна (или меньше) 1/3. Однако любые реалистические оценки дают значения p больше 1/3 [16]. Достоверные сведения о локализации сильных и слабых связей в воде отсутствуют. Предложено [16], что сильные тетраэдрические связи образуют компактные области (кластеры, глобулы), а слабые связи соответствуют более разупорядоченным участкам единой сетки, расположенным на границах между ними. Для установления зависимости между функциональной организацией клеток железы и структурой воды нужно не только качественное, но и количественное описание структуры. Для этого конкретизируем предложенную в [16] локализацию слабых связей допущением, что из n активных центров кластера, направленных к соседним кластерам,
Pc = n · Pп / 4 - образуют сильные связи. Величина Pc фактически является порогом перколяции кластера в целом. Если в шарообразном кластере в среднем содержится g мономеров и 4g активных центров, то
где предполагается, что мономеры, расположенные на поверхности кластера, могут иметь a активных центров, направленных в сторону соседних кластеров, и b - во внутреннюю область кластера. От соотношения параметров a и b, которые в общем случае могут принимать значения целых чисел от 0 до 4, существенно зависят результаты моделирования структуры системы. Структуру аморфного германия, например, исследовали при значении a = 2 [18]. Для оценки температурной зависимости распределения активных центров на поверхности кластера положим, что вода в жидкой фазе является гелем [19], в состоянии идеального газа при объёме жидкости - золем, а переход гель-золь определяется свободной энергией молекулярного взаимодействия (A)
где R - газовая постоянная, T - абсолютная температура. Сравнивая справочные и расчётные значения величины A при различных значениях параметра а, можно получить информацию о некоторых особенностях структуры жидкости.
Все величины в соотношениях (8-12) можно найти при известных значениях средних чисел мономеров в кластерах (g). Для определения последних положим, что в свободной энергии кластера в целом можно выделить поверхностную и объёмную составляющие. Для таких дисперсных систем получено соотношение [20]
где U - поверхностное натяжение, V - молярный объём жидкости, Rд - радиус дисперсной частицы. В отличие от дисперсных частиц кластеры взаимодействуют друг с другом, при этом объёмы кластеров перекрываются, а площадь поверхности - уменьшается. Учтём это введением коэффициента y в левой части уравнения (13), а в правой части последнего введём множитель w, связанный с дифференцированием (по числу кластеров) факториала g!, разложенного в ряд Стирлинга. С учётом также радиуса кластера Rд = r·g 1 / 3, где r - эффективный радиус мономера в кластере, соотношение (13) имеет вид
Коэффициент y оценивали из явления контракции воды при плавлении твёрдой фазы по формуле
где Vл и Rл, V и Rж - объём и межмолекулярное расстояние льда (при температуре плавления) и жидкости (при температуре Т), соответственно.
Результаты расчётов по формулам (8-12) согласуются с ранее полученными другими методами [21]. При 313 К в кластере содержится в среднем 17 молекул. Последнее число уменьшается на 1 при повышении температуры на 5 К. Это, как отмечалось [22], может быть одной из причин увеличения размеров "поры", что в большей мере должно способствовать усилению пассивного переноса катионов натрия, чем катионов калия. Существенным является то, что уменьшение числа мономеров в кластере ниже 17 может привести к изменению конформации кластера и, соответственно, структуры системы [18]. Это подтверждается также расчётами свободной энергии образования золь-фракции A по уравнению (12). Последняя совпадает с данными [23] при 273 К в случае a=1 и при 358 К, когда a = 2. Если предположить, что в области температуры гомеостаза в воде преобладают кластеры с отмеченными значениями параметра a, то при температуре 312 К наблюдается примерное равенство содержания на поверхности кластеров мономеров с одним и двумя активными центрами, направленными к соседним кластерам. Увеличение доли "внешних" активных центров в кластерах воды в процессе гипертермии молочной железы может сопровождаться изменением конформации кластеров и ионофоров, что должно сказываться на активном переносе катионов.
Проведём сравнение некоторых количественных характеристик кластеров воды и гидра тированных катионов калия и натрия в условиях "нормы" (310 К) и "патологии" (315 К). Радиус (нм) кластеров воды - 0.495 и 0.485, катионов калия - 0.247 и 0.253, натрия - 0.301 (по данным [24]); координационное число воды - 4, калия - 2, натрия - 4; порог перколяции (9) воды - 1/3, калия - 1-1/3, натрия - 1/3. Катион калия оказывает разрушающее действие на структуру растворителя [25], при течении раствора удерживает две молекулы воды [24] из четырёх [26]. При пассивном транспорте ионов в гидратированной поре, имеющей канал диаметром до 0.8 нм [12], образуется узкий кольцевой зазор. При таких условиях скорость движения иона должна быть пропорциональна зазору в третьей степени и обратно пропорциональна радиусу иона (при прочих равных) [27]. Если приращение радиуса канала в процессе гипертермии молочной железы приравнять уменьшению диаметра кластера, то при диаметре канала в норме 0.8 нм пассивный перенос катионов натрия при патологии (относительно "нормы") в 1.3 раза превышает таковой для калия, а при диаметре канала 0.75 - 0.76 нм достигается полуторакратное превышение.
Экспериментальное и теоретическое исследование электропроводимости и ионного состава молока в зависимости от степени развития мастита показывает обоснованность и перспективность использования этих методов в экспресс-диагностике мастита у продуктивных коров как с целью своевременной профилактики последнего, так и с целью контроля качества молока. Рассмотренные методы могут быть также применены для изучения и контроля состояния молочной железы других животных, в том числе, свиней, собак. Однако, с целью учета видовых физиологических особенностей и особенностей лактации последних, необходимы дополнительные исследования для адаптации методики и приборов.